磺胺三合一檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液等樣本中的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的磺胺類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗磺胺類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。
2 磺胺三合一檢測(cè)試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.2ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
組織（高檢測(cè)限方法）……………………0.2ppb
組織（低檢測(cè)限方法）……………………2ppb
血清、尿液、雞蛋………………………0.8ppb
蜂蜜………………………………………0.2ppb
牛奶………………………………………4ppb
飼料………………………………………8ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
藥物名稱
交叉率
靈敏度
磺胺甲基異噁唑（SMZ）
100%
0.2ppb
磺胺間甲氧嘧啶（SMM）
67%
0.3ppb
磺胺嘧啶（SD或SDZ）
33%
0.6ppb
 2.5 樣本回收率：
組織、蜂蜜、雞蛋………………………………85±25%
尿樣、牛奶、血清、飼料………………………80±25%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說(shuō)明書(shū)………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCl、NaH2PO4·2H2O 
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：0.1M  磷酸鹽緩沖液
    稱取25.8g Na2HPO4·12H2O和4.4g NaH2PO4·2H2O加去離子水1000ml溶解。
配液2:乙腈-乙酸乙酯溶液
    取50ml乙腈和50ml乙酸乙酯加入100ml玻璃瓶中，混勻。
配液3：0.5M鹽酸溶液
    4.3ml濃HCl加入去離子水定容至100ml混勻。
配液4：0.2M  NaOH溶液
    0.8gNaOH用去離子水100ml溶解
配液5：復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本（高檢測(cè)限）處理方法
1）稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入1ml 0.1M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)樣本成糊狀，加入7ml乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心5min；
2）移取4ml上層清澈有機(jī)相至干燥容器中，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?br />3）加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入樣本復(fù)溶液1ml。振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；
4）去除上層正己烷，取50µl下層水相用于分析。  
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.2ppb
5.3.2 組織樣本（低檢測(cè)限）處理方法
1）稱1.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入9ml 0.1M 磷酸緩沖液，震蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min； 
2）取50µl上層液體用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù): 10    檢測(cè)下限：2ppb  
5.3.3 雞蛋樣本處理方法
1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；
2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min以上離心5min；
3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?br />4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)1min，室溫4000r/min以上離心5min；
5）去上層有機(jī)相，取下層水相50ul用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測(cè)下限：0.8ppb  
5.3.4 血清樣本處理方法 
1）將血樣本于室溫放置30min，室溫4000r/min以上離心10min，分離出血清或過(guò)濾血清；
2）取1ml血清，加入3ml 0.1M PB緩沖液混合，混合30s；
3）取50µl用于分析。  
    樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測(cè)下限：0.8ppb
5.3.5 蜂蜜樣本處理方法
1）稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min；
2）加入2.5ml 0.2M * (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心5min；
3）取2ml上層液體于50℃下氮?dú)獯蹈桑?.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；
4）取50µl用于分析。  
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測(cè)下限：0.2ppb
5.3.6 尿樣本處理方法
1）用3ml 0.1M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s； 
2）取50µl液體用于分析。  
    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測(cè)下限：0.8ppb 
5.3.7 牛奶樣本處理方法
1）取100ul牛奶樣本用0.1M PB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋（即100ul牛奶+1.9ml 0.1M PB緩沖液），混合30s；
2）取50µl用于分析。  
    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：4ppb     
5.3.8 飼料樣本處理方法
1）稱取2.0±0.05g飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；
2）移取1ml上層有機(jī)相至10ml潔凈干燥玻璃試管中，在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?br />3）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入1ml 0.1M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)30s混勻，轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中，室溫4000r/min以上離心5min；
4）除去上層有機(jī)相，移取100ul下層水相至2ml離心管中，加入 900ul 0.1M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)1min，混勻；
5）取50ul用于分析。
   樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測(cè)下限：8ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索取）
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。