蘇丹紅檢測試劑盒使用說明書（酶聯免疫法）
 
 1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測番茄醬、辣椒醬、蛋等樣本中的蘇丹紅（Sudan，SUD），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的蘇丹紅和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗蘇丹紅抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含蘇丹紅含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的殘留量。
2 蘇丹紅檢測試劑盒技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
番茄汁/番茄醬/辣椒醬………………20ppb
辣椒粉(辣椒面）/飼料………………200ppb
蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵝蛋）……………10ppb
2.4 交叉反應率：
蘇丹紅…………………………………100%
對位紅…………………………………123%
羅丹明…………………………………8%
2.5 樣本回收率：
番茄汁/番茄醬/辣椒醬…………80% ±10%
辣椒粉(辣椒面）/飼料…………65% ±10%
蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵝蛋）………70% ±10%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準液（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液1：復溶液
    將5×復溶液用去離子水5倍稀釋，用于樣本的復溶，復溶液在4℃環境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 番茄汁/番茄醬/辣椒醬
1）稱取1±0.05g均質樣品于離心管中，加入5ml甲醇，振蕩5min，15℃下4000r/min以上離心10min；
2）移取10µl上清液與390µl已稀釋好的復溶液混勻；
3）取50µl用于分析。  
    樣本稀釋倍數：200    檢測下限：20ppb
5.3.2 辣椒粉、飼料
1）稱取1±0.05g樣本于離心管中，加入10ml甲醇，震蕩5min，15℃下4000r/min以上離心10min； 
2）移取10µl上清液 與1990µl已稀釋好的復溶液復溶混勻；
3）取50µl液體用于分析。
    樣本稀釋倍數: 2000    檢測下限：200ppb  
5.3.3 蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵝蛋）
1）用均質器低速均質蛋類樣本（熟蛋取樣蛋黃，生蛋取樣全蛋）；
2）稱取1±0.05g均質后蛋類樣本于離心管中，加入5ml甲醇，振蕩5min，15℃下4000r/min以上離心10min；
3）移取10µl上清液 與190µl已稀釋好的復溶液混勻；
4）取50ul用于分析。
    樣本稀釋倍數:100    檢測下限：10ppb  
備注：如樣品嚴重污染較多雜質或殘留物嚴重超標，應進
一步稀釋后重新分析。
6 酶聯免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。
6.3 洗    滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：加酶標記物100µl/孔，25℃避光反應30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索取）
8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。